TopHat错误分析与解决
背景介绍
TopHat 是一种用于 RNAseq 数据比对的工具，常用于转录组测序数据的处理，它能够将 RNAseq 读取序列高效地比对到参考基因组上，并支持检测融合基因等高级功能，TopHat 依赖 Bowtie 或 Bowtie2 作为其核心的比对引擎，本文将详细解析 TopHat 报错的常见原因以及相应的解决方法。
常见报错及解决方法
Bowtie 索引文件未找到
报错信息：
Error: Couldn't build bowtie index with err = 1
原因：
该错误通常表明 TopHat 无法找到 Bowtie 索引文件，可能的原因包括路径配置错误或索引文件不存在。
解决方法：
确保 Bowtie 索引文件路径正确，并且包含所有必要的后缀文件（如.1.ebwt,.2.ebwt,.3.ebwt,.4.ebwt,.rev.1.ebwt），如果基因组名称为rabbit.fasta，而.bt2 文件存放在/home/ 目录下，完整的路径应为/home/rabbit，且不要加上.fasta 后缀。
Bowtie2 版本问题
报错信息：
Error running: /home/ganges/zhusheng/tophat2.1.1.Linux_x86_64/bam2fastx all ./tophat_out/tmp/left_kept_reads.bam|/home/ganges/zhusheng/bowtie22.3.0legacy/bowtie2 k 20 D 15 R 2 N 0 L 20 i S,1,1.25 gbar 4 mp 6,2 np 1 rdg 5,3 rfg 5,3 scoremin C,14,0 p 1 samnohd x test_ref |/home/ganges/zhusheng/tophat2.1.1.Linux_x86_64/fix_map_ordering bowtie2minscore 15 readmismatches 2 readgaplength 2 readeditdist 2 readrealigneditdist 3 indexoutfile ./tophat_out/tmp/left_kept_reads.mapped.bam.index samheader ./tophat_out/tmp/test_ref_genome.bwt.samheader.sam ./tophat_out/tmp/left_kept_reads.mapped.bam ./tophat_out/tmp/left_kept_reads_unmapped.bam
原因：
Bowtie2 版本不兼容可能导致比对失败。
解决方法：
尝试使用旧版本的 Bowtie2（如2.1.0）进行比对，可以通过下载并安装指定版本的 Bowtie2 来解决此问题。
FASTA 文件未找到
报错信息：
Warning: Could not find FASTA file bowtie2_index/GRCm39_index.fa但不提示error，照常preparing reads，但生成不出有效文件，报错如下
原因：
TopHat 无法找到参考基因组的 FASTA 文件。
解决方法：
在 Bowtie2 索引文件夹内，重新对参考基因组文件（如GRCm39.fa）创建软链接，命名为GRCm39_index.fa。
扩展：TopHat2 环境配置与运行
环境配置
TopHat2 必须在 Python 2.7 环境下运行，可以使用 Conda 创建虚拟环境来管理依赖：
conda create name python27 python=2.7 y conda activate python27
然后下载并解压 TopHat2：
wget http://ccb.jhu.edu/software/tophat/downloads/tophat2.1.0.Linux_x86_64.tar.gz tar zxvf tophat2.1.0.Linux_x86_64.tar.gz
将 TopHat2 的路径添加到环境变量中：
export PATH=/path/to/tophat2.1.0.Linux_x86_64/:$PATH
修改 TopHat2 的启动脚本，使其指向 Conda 环境中的 Python 2.7：
vim tophat2.1.0.Linux_x86_64/bin/tophat
将第一行的#!/usr/bin/env python 改为#!/path/to/miniconda2/envs/python27/bin/python2，保存并关闭文件。
运行 TopHat2
配置完成后，可以运行 TopHat2 进行比对：
tophat r 20 test_ref reads_1.fq reads_2.fq
TopHat 是一个强大的 RNAseq 数据处理工具，但其复杂性也带来了一些常见的报错，通过正确配置环境、确保索引文件存在以及选择合适的软件版本，可以有效地解决这些报错，希望本文提供的信息能够帮助用户顺利运行 TopHat，进行高效的 RNAseq 数据分析。
FAQs
1. TopHat 如何创建 Bowtie 索引文件？
TopHat 使用 Bowtiebuild 工具来创建索引文件，确保已经安装了 Bowtie，使用以下命令创建索引文件：
bowtiebuild genome.fa prefix
其中genome.fa 是参考基因组文件，prefix 是索引文件的前缀。
2. 如何解决 TopHat2 运行中的 "basic_exception.h:236 FAILED" 错误？
这种错误通常表明 TopHat2 在运行过程中遇到了无法处理的异常情况，可以尝试以下方法解决：
确保输入数据的质量，避免低质量的序列对比对过程的影响。
检查参考基因组和注释文件是否正确配置。
尝试更新或降级 Bowtie2 版本，以排除版本兼容性问题。
如果错误持续存在，查看详细的错误日志，寻找更多的线索。
